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口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。目前，口蹄疫是全球最重要的动物健康问题之一，世界大部分地区时有发生，常在牛群及猪群大范围流行。此病的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为：口腔粘膜、舌面、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，怀孕母牛可能流产，而后导致繁殖力降低，猪则以破蹄为最主要症状，山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫的大规模流行，会给农牧业生产造成极大的危害，并波及到市场上毛、皮、肉、奶的供应以及以毛、皮、肉、奶为原料的食品加工业和轻工业，给畜牧业和进出口贸易造成巨大的经济损失，直接威胁着国家声誉和人类食品卫生安全，因而受到国内外的普遍关注。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为A类家畜传染病之首。口蹄疫病毒（FMDV）为单股、正链RNA，约有8500个核苷酸，病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒共有7个血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型，每个型又可以进一步分为亚型。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。口蹄疫在世界各地几乎都被列为必须申报的疾病，诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、扁桃体及心脏。样品应冰冻保存，或置pH7.6的甘油缓冲液中。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术等。 1 病毒分离技术 病毒分离技术是检测口蹄疫的黄金标准，主要有细胞培养和动物接种2种方法(黄银君，1995)。 1.1 细胞培养 检测口蹄疫最初用的细胞是单层初代猪肾细胞，后来随着细胞培养系统的不断增多，有许多培养细胞都可用于FMDV的分离。其中初代小牛甲状腺（CYT）细胞分离FMDV时特别敏感，此外还有小牛肾细胞、仓鼠肾细胞系BHK21等。一些样品在经过长途运送后，由于病料受到各种因素的影响，可能只有少量的感染病毒存活，CYT细胞在检测这种病料时具有特殊的价值。目前许多实验室都将CYT细胞和IBRS2培养细胞（猪肾细胞系）作为分离FMDV的常规细胞。这2种细胞系可将FMDV和SVDV（猪水泡病病毒）区分开，因为FMDV可在这2种细胞上生长，且有相似的细胞病变，而SVDV只能在IBRS2细胞上生长。 1.2 动物接种 动物接种常用乳鼠进行，通常情况下进行病毒分离需要用8～10只小鼠，以便于观察接种鼠的死亡情况和获得足够多的抗原，并在进行补体结合试验（CFT）时获得明显的阳性结果。当致病性毒株非常重要时，也可用牛等动物来分离病毒。 2 血清学诊断技术 血清学诊断技术主要有病毒中和试验（VNT）、CFT、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等。 2.1 补体结合试验 CFT是较早的应用于诊断FMD的血清学诊断技术之一，最初的CFT是在试管中进行的，后来被微量法所替代，微量法操作简便，节省试剂，但是CFT的敏感性不高，且易受样品中的亲补体性和抗补体物质的干扰。 2.2 病毒中和试验 病毒中和试验是OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法。在进行抗原鉴定时病毒中和试验比补体结合试验要好，但体外VNT试验也有一些缺点，如需用的细胞生长不一致、病毒敏感性的变化、外源性微生物因子(如细菌和真菌)的可能性干扰以及被试血清对细胞的不同影响等等，这一方法必须使用活病毒，非普通实验室所能操作，而且中和试验全然不能区分免疫抗体和感染抗体(黄银君，1995)。 2.3 酶联免疫吸附试验 ELISA试验检测口蹄疫具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。 杨永钦等(1994)建立了检测FMDV的斑点ELISA检测方法（分为一步法和间接法）结果证实，用硝酸纤维素膜作固相载体，很好的解决了在常规ELISA中使用的聚苯乙烯微量反应板对抗原或抗体包被不牢的缺点，提高了诊断的准确性和可靠性，而且可以制成方便携带的诊断膜，运用更为方便，而且操作简单，缩短了试验周期，完全可以在野外进行实地诊断检测，在基层具有良好的运用推广前景，但是由于一步法的操作更为简化，敏感性稍有下降。 杨永钦(1994)还研制出用于检测FMD的生物素亲和素强化斑点ELISA试验方法，用光敏素标记的纯化A蛋白代替第二抗体，通过AP标记的亲和素检测生物素化抗体，最后加底物BCIP和NBT显色判定，该法具有良好的重复性和特异性，由于引入生物素系统和AP，使灵敏度大为提高，能检出微量抗体，比常规ELISA更为敏感。Sorensen等(1992)建立了可检测FMD抗SAT1、SAT2、SAT3血清型病毒抗体的生物素亲和素系统阻断ELISA方法，并与世界参考实验室的液相ELISA方法进行了比较，结果证实，该方法具有高特异性和灵敏性，可作为抗体水平评估的一种精确可行的方法。 美国联合生物制药公司于2000年成功推出以合成肽为基础的FMD ELISA试剂盒，目前已在世界多个国家和地区使用。我国中牧集团与美国UBI公司已在我国进行了较大规模的试用，取得了良好的应用效果。该试剂盒是根据传统的ELISA方法设计的，所不同的是采用的包被抗原是化学合成的非结构蛋白3B和结构蛋白VP1中的抗原位点来取代传统的病毒抗原或生物合成抗原，并可区分免疫抗体和感染抗体(潘文波等，2001)。 口蹄疫病毒基因所编码的一个大的聚蛋白可逐级裂解病毒结构蛋白和非结构蛋白，在逐级裂解中产生的非结构蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋白的免疫原性比其他非结构蛋白弱，感染动物不一定能产生抗体，即使产生抗体，维持的时间也比较短。病毒感染动物可产生抗2B抗体，但这种抗体在ELISA反应中重复性不好，不能作为检测抗体。2C抗体由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可检测到2C抗体，因此也不能作为检测指标。3D又称病毒感染相关抗原，没有型特异性，检测其抗体是评价动物是否接触过抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。目前认为仅检测3D抗体不能区分感染动物与免疫动物，因为疫苗中往往含有痕量的非结构抗原,经过多次免疫后,在免疫动物体内也能检测到3D抗体。3ABC聚蛋白中，3A免疫原性最强，3C免疫原性较弱。许多资料认为3ABC作为感染的标志可信度较大。检测3ABC抗体是确诊感染的重要指标。 朱彩珠等(2003)利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）3ABC多肽作为抗原建立了一种可以区分FMDV感染与接种灭活苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验，并通过大量的临床试验确定了血清抗体阳性与阴性效价的临界值。该方法的原理为：动物在感染FMDV后既产生结构蛋白抗体，也产生非结构蛋白抗体，而接种纯化灭活病毒后，几乎只产生结构蛋白抗体。经过大量试验结果证明，该ELISA方法灵敏度比VIAAAGID（病毒感染相关抗原琼脂糖凝胶免疫扩散试验）高。意大利的De等(1997)研制出基于3ABC蛋白的间接捕获ELISA技术，并可区分野毒感染和疫苗毒感染。在这套ELISA方法中，应用单抗来捕获在大肠杆菌中表达的3ABCFMDV非结构聚合肽，并将OD值小于0.２的样品判为阴性。用此ELISA技术监测了大量的经过免疫的和感染的动物，所有的经过攻毒试验的动物其ELISA试验的OD值都大于0.2，超过99％的经过疫苗免疫的动物ELISA结果为阴性（即小于0.2），显示出该方法良好的敏感性。后经特异性试验结果证实，该方法的特异性大于99.5％。针对3ABC抗原的抗体最早可于免疫后8 d测出，并且抗体测出时间可长达至少1年。此ELISA方法安全、经济。鉴于其优良特点，可参与FMD根除运动和防控计划。丹麦的Sorensen等(1998)开发出以杆状病毒表达的抗原构建的ELISA方法，可分别检测非结构蛋白3AB、3ABC、3D，其中3AB、3ABC、3D ELISA均可检测FMDV的7种血清型病毒抗体。3DELISA与检测结构蛋白的ELISA方法相比，具有相当的特异性、准确性和敏感性，他们同时也证实3AB和3ABCELISA可在免疫后的畜群中判断是否存在野毒感染。德国的Bruderer(2004)也成功的建立了3ABCELISA方法。Kweon等(2003)以杆状病毒表达的非结构蛋白3A为抗原，以抗3A的单抗作为捕获抗体，建立起间接捕获ELISA方法，此方法与3ABCIELISA相比，具有相当的敏感性和特异性，适合作为诊断FMDV感染的方法。 Bronsvoort等(2004)报道，对2种3ABCELISA的商业试剂盒(CHEKITFMD3ABCELISA和COMPETITIVE3ABCELISA)在喀麦隆口蹄疫流行地区进行比较，前一种试剂盒的特异性为98％，敏感性为23％。后一种试剂盒的特异性为90％，敏感性为71％。台湾的Lee(2004)等将用于检测FMDV非结构蛋白抗体的3种试剂盒(CHECKITFMD3ABC、UBIFMDNSELISA和 DVIVRNSPELISA)进行了比较，认为DVIVRNSPELISA试剂盒具有最高的敏感性。 Bergmann等比较了以3A、3B、2C和3ABC为抗原的ELISA方法检测感染牛的敏感性和准确性，认为，目前利用非结构蛋白3AB和3ABC是鉴别FMDV感染与免疫的最可靠的指标。Malirat等用试验血清和田间血清对3ABCELISA进行了详细的评价，并与电转移免疫印记试验进行了比较，认为3ABCELISA是普查FMD感染动物的最好方法(Malirat等，1998；Brocchi等，1998)。Sorensen等(1998)用牛、羊的血清比较了3DELISA和3ABCELISA的特异性和敏感性，证实3DELISA方法对羊血清的敏感性为98％，特异性为100％。对牛血清的敏感性为97％，特异性为100％，而3ABCELISA方法对牛血清的敏感性相对较差。对牛血清的特异性为99.8％，对羊血清的特异性为100％。但同时也指出，只检测3D抗体不能区分感染动物和免疫动物。在针对非结构蛋白的检测方法中，用于表达非结构蛋白的载体往往由于产生抗体而影响反应的非特异性，为减少由此而带来的假阳性，我们可以采用2种方法：①同时应用一个验证试验；②应用单抗来捕获重组蛋白（3ABC）。 McCullough等(1985)建立了一种液相ELISA，此ELISA比间接ELISA敏感6～8倍，在效能上与双夹心或抗原捕获ELISA相当，可用于检测抗原抗体反应及杂交瘤细胞培养上清的检测。 Hamblin等(1987)建立了用于检测FMD抗体的液相阻断夹心ELISA，经过大量的应用结果表明此ELISA试验比病毒中和试验更敏感，检出率更高。Van等(1990)也证实液相阻断夹心ELISA试验的重复性要比血清中和试验更好。Ferris等(1990)证实，在液相阻断ELISA中灭活和未灭活的病毒都可以作为抗原。在ELISA试验中不用活的抗原可以减少感染疾病的风险，拓宽试剂盒检测抗体的应用范围。Smitsaart等(1990)建立的阻断ELISA也证实敏感性比CFT好，接近病毒分离的黄金标准。 新西兰的Oliver等(1988)将检测抗原的双抗体夹心ELISA与CFT就检测抗原方面的效果进行了比较，结果用ELISA方法在口部样品中的70％检测到病毒，脚部样品中的92％检测到病毒，而采用CFT方法，仅在口部样品中的44％和脚部样品中的85％检测到病毒。从而证实CFT方法的敏感性不如ELISA方法。同时试验结果证明，脚部水泡上采集的病料比口部水泡上采集的病料病原更易培养，检测时限也更长，因此在病料采集的过程中要注意采集脚部的病料。 Westbury等(1988)建立了一种单稀释阻断ELISA，并通过对176份样品的检测建立了阳性阴性的判断标准和阻断血清的稀释度（1∶16），经过与病毒中和试验对比结果表明，该方法更敏感、特异且可以重复检测，可以作为一种快速、有效的血清学检测方法。Van(1990)建立了可检测A、O、C型FMDV的单抗介导的复合型捕获阻断ELISA方法，在这个方法中，同时应用2个单抗分别针对抗原上不同的抗原决定簇，有感染力的、未灭活的和灭活的FMDV都可以应用于此ELISA方法中。此ELISA方法和其他ELISA方法一样，不仅敏感性好，而且诊断快速，可重复测定，用其在疫苗效力试验中对免疫应答水平进行评估非常实用。 阿根廷的Odonneu等(1996)应用3D蛋白开发出3D液相阻断夹心ELISA用于检测FMD抗体。此ELISA可检测自然或实验室感染的A、O、C型FMD抗体，感染后最早5 d即可测到抗体。此ELISA方法可用于检测病毒活性及对未感染FMDV动物的证实。 Mackay等(1996)建立起诊断FMD的固相竞争ELISA方法，以灭活的纯化FMD病毒为抗原，并在系统中应用了多克隆抗血清，与液相阻断ELISA相比，敏感性与液相阻断ELISA相当。Chenard等(2003)建立了一种简便的固相阻断ELISA检测O型FMDV所刺激而产生的抗体。用此方法对感染和未感染FMDV的牛、猪和羊进行了大量的血清田间试验，结果证实特异性为96％，对148份感染FMDV的猪、牛和羊的血清进行检测，证实其敏感性大于99％，特异性和灵敏性满足ELISA的检测要求。 俄罗斯的Lomakina等(2004)建立了检测FMDV的PCRELISA方法，在PCR中应用的是针对3D蛋白基因的通用引物。应用该方法成功的检测到32株口蹄疫病毒株。 Craig等(1989)经过试验证实在ELISA试验中，酶标板对口蹄疫病毒的吸附情况受包被液的影响较小。最佳包被条件为用0.01 M pH8.0的磷酸盐缓冲液。Ferris等证实预先用碳酸钠和碳酸氢钠包被的酶标板可在4℃和-20℃保持敏感性140 d，但是在18～24℃和37℃则反应性下降，当用碳酸铵盐作包被缓冲剂时可显著提高反应性。将兔抗血清冻干处理或稀释于碳酸钠或碳酸氢钠时，体系的反应性较强。当应用单抗来检测抗原时,包被缓冲液起的作用更大。且与通常所用的包被液不同。Craig等(1989)证实,当应用ELISA检测FMDV时,效果较好的酶标板有Nunc 439454、Flow 7717205和Dynatech M129B。 3 分子生物学诊断技术 近年来，随着分子生物学的飞速发展，以及对FMDV研究的不断深入，已经建立起检测FMDV的各种分子生物学方法，其中包括聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等等(朱彩珠等，1996；罗长保等，2003)。 在PCR技术中，应用于检测FMDV的有直接PCR、荧光RTPCR、RTPCR、双倍PCR、实时PCR等。PCR技术不仅可用于检测组织中存在的病毒，还可以用于序列分析，并可以鉴定出病毒的血清型，其特异性和灵敏性均比血清学方法高，而且快速、可重复试验，甚至可以检测出长时间存放的化学灭活的商品疫苗。因此是一种十分实用的实验室检测方法。Reid等(2003)通过大量的试验评估了RTPCR的作用，认为这种方法仍需完善，要使RTPCR的敏感性和特异性更高，可利用内部引物来进行二次扩增或用ELISA、杂交或标记探针法来作证。 寡核苷酸指纹图谱法目前已被核苷酸序列分析所替代。通过对所分离的样品进行序列分析并与标准株资料库的核苷酸进行比较，可以判断出其同源性，进而确定出毒株在系统进化树中的位置，并确定出其在流行病学中的关系。 由于FMDV的完整病毒粒子的结构和成分比较简单（由VP1、VP2、VP3、VP4组成），在电聚焦技术中，FMDV诱导的肽通常都能聚成清晰的、单一的条带，因此可在单相聚焦时与其他的病毒进行比较。电聚焦技术可以快速、简单的、大量分离病毒株，常被应用于FMDV的病毒株的遗传变异分析中，在流行病学的研究中具有较大的运用潜力(黄银君等，1995)。 |
